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How to perform a CRISPR Knockin Experiment - YouTube
Channel: Applied Biological Materials - abm
[5]
La capacidad de insertar, o incorporar un gen
en un locus espec铆fico es un m茅todo tremendamente 煤til
[10]
para analizar los mecanismos de una enfermedad.
[12]
Sin embargo, en a帽os anteriores, la inserci贸n
de un gen extra帽o fue demasiado tediosa
[17]
y costosa para muchos laboratorios.
[20]
Gracias al reciente desarrollo de la tecnolog铆a
CRISPR / Cas9, los experimentos knock-in de generaci贸n de genes se han
[25]
convertido en una t茅cnica muy popular en la biolog铆a
molecular moderna.
[29]
A diferencia de los sistemas de integraci贸n aleatoria
por el sistema lentiviral, CRISPR utiliza
[35]
una gu铆a de ARN que dirige la inserci贸n de genes con
extraordinaria especificidad.
[40]
In particular, the AAVS1 safe harbour site
es el m茅todo de transfecci贸n preferido para los genes knock-in.
[48]
Esto se debe a que permite la expresi贸n del transg茅n consistente y
robusto con m铆nimos efectos t贸xicos.
[54]
En este safe harbour site, el ADN circundante
mantiene una conformaci贸n abierta que permite
[58]
la expresi贸n estable del transgen reci茅n insertado.
[62]
Esto hace que los sitios portuarios seguros, como el
clocus AAVS1 en el cromosoma humano 19, y el
[67]
locus ROSA26 en el cromosoma 6 de rat贸n, sean sitios muy populares
para experimentos knock-in dirigidos.
[74]
En este caso, te mostraremos como un gen de prote铆na
fluorescente roja fue introducida (knock-in)
[79]
en c茅lulas de ri帽贸n embrionario humano en el
safe harbour site de AAVS1.
[84]
Tambi茅n demostraremos c贸mo se verific贸 el knock-in
utilizando un m茅todo basado en PCR.
[90]
Para comenzar, un ARNs se dise帽贸 para dirigirse
al locus humano de AAVS1.
[97]
El an谩lisis de software se realiz贸 para garantizar
la m谩xima eficacia de la divisi贸n en el objetivo,
[102]
evitando cualquier efecto off-target.
[105]
La secuencia de gu铆a resultante se us贸 para construir
el Vector-todo-en-uno con objetivo AAVS1 de ABM.
[112]
Este vector expresa la endonucleasa Cas9
bajo un promotor CMV
[116]
y el ARNsg bajo un promotor U6.
[120]
Para lograr el knock-in, se requiere un pl谩smido donante
que contenga el gen de inter茅s para proporcionar
[125]
una plantilla para la reparaci贸n directa por homolog铆a(HDR)
[128]
La ruta HDR es un mecanismo en las c茅lulas que
repara las roturas de doble cadena utilizando una plantilla de reparaci贸n de ADN
[134]
hom贸loga a los sitios adyacentes
de la zona superior e inferior del sitio de rotura.
[140]
Para permitir la inserci贸n del gen mediado por HDR, el
gen de inter茅s debe estar rodeado por
[146]
dichos brazos de homolog铆a.
[147]
Por lo tanto, se construy贸 un segundo pl谩smido
clonando un casete de expresi贸n de RFP-puromicina
[154]
en el pl谩smido molde de reparaci贸n de ABM para el
locus AAVS1.
[160]
El pl谩smido pAAVS1-Donor-RFP resultante ten铆a
el gen RFP bajo un promotor CMV y un marcador de resistencia
[167]
a puromicina bajo un promotor PGK.
[171]
Una vez que ambos pl谩smidos estan listos, se introducen
en las c茅lulas HEK293 usando el reactivo de transfecci贸n
[176]
DNAfectin.
[181]
Despu茅s de la transfecci贸n, las c茅lulas se han cultivado
diez veces para diluir el vector donante episomal.
[187]
A continuaci贸n, las c茅lulas HEK293 resultantes
tomaron 3 a 4 semanas para crecer en presencia
[192]
de puromicina para seleccionar las c茅lulas con knock-in
exitoso en el casete de resistencia a RFP-puromicina.
[200]
Las c茅lulas transfectadas con el vector All-in-One
dirigido a AAVS1 y el pl谩smido pAAVS1-Donor-RFP
[208]
estaban saludables despu茅s de 4 semanas, y m谩s del
95% de las c茅lulas HEK293 expresaban
[213]
con 茅xito RFP!
[216]
Las c茅lulas de control que no se transfectaron con
los vectores murieron despu茅s del tratamiento con puromicina.
[222]
La genotipificaci贸n de PCR se llev贸 a cabo para confirmar que el
[226]
knocked-in en RFP fue exitoso en AAVS1.
[230]
En este m茅todo, se dise帽aron dos cebadores:
el cebador 1 dirigido al brazo de homolog铆a 5 'cadena arriba
[237]
del RFP y el cebador 2 dirigido a un sitio dentro
del cassette de resistencia RFP-Puromicina.
[244]
El gen knock-in se confirm贸 cuando se observ贸 un producto de PCR
de 1,1 kb que indicaba que los cebadores
[250]
1 y 2 eran capaces de unirse al genoma editado
para permitir una amplificaci贸n por PCR satisfactoria.
[257]
En el caso de un knock-in no exitoso o
en presencia de c茅lulas de wild type (WT),
[263]
no se observaron productos de PCR ya que el cebador 2
no pudo emparejarse al sitio diana
[267]
y permitir la amplificaci贸n.
[271]
Esperamos que este estudio de caso haya demostrado c贸mo
la t茅cnica knock-in del gen basado en CRISPR puede
[277]
hacer que la exploraci贸n de la funci贸n de los genes sea incre铆blemente
f谩cil y eficiente.
[281]
CRISPR / Cas9 gen mediado knock-ins permite
modificaciones bial茅licas de algunos genes que se
[288]
generan con facilidad, con cambios fenot铆picos
en ratones observables en una sola generaci贸n
[294]
un marco de tiempo sin precedentes!
[297]
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que desees, con un m铆nimo de efectos t贸xicos en
los sitios Safe Harbor de AAVS1 o ROSA26.
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